1	生物工程概论课件制作与主讲：汪玉琳　　　　　2004.2
2	第一讲　　生物工程概况一、生物工程技术与生命科学变革二、生物工程的产生与发展三、生物工程的基本内容四、生物工程在国民经济中的地位
3	一、生物工程技术与生命科学变革 1、 21世纪生命科学将成为自然科学的带头学科生物技术将使生物产业成为全社会的产业支柱基因科学在疾病的诊断和治疗中应用广泛人体的器官和组织“重造”及修复方面取得巨大进步基因工程将引发一场新的绿色农业革命生物技术还可能为计算机领域的研究带来突破
4	2、生命科学未解的八大奥秘
5	3、现代生命科学研究的的热点 1、以蛋白质工程为主要内容的生物大分子结构与功能研究 2、以信号传递和相互作用为基础的基因控制细胞机理研究 3、在完成人类及所有生物基因测序后对基因结构和遗传语　言研究 4、开展包括分子水平上的以实现遗传、发育、进化大统一为目的的综合理论研究 5、研究神经网络和神经信息处理机制，揭示脑工作原理 6、心理、智力、性格、行为模式的行为学机制和量化研究 7、生态学在微观与宏观结合、理论与控制结合上进行定量、　预测和工程化方向研究 8、人体功能(包括潜在功能如经络、气功、特异功能等方　面)研究另外：人工生命体的合成
6	二、生物工程的产生与发展生物工程是生物学技术的工业化，是生物技术和工程学的结合。分子生物学一一20世纪50年代DNA双螺旋结构的确定和用X射线对蛋白质晶体空间结构的测定， 1973年，限制性内切酶的发现和应用、重组DNA的成功实现、开创了基因工程 20世纪90年代，细胞克隆，特别是体细胞克隆获得成功，使细胞工程开始走向产业化。DNA芯片、生物计算机的出现，使生物材料的应用走向高台阶。在世纪之交，人类基因组测序、酵母基因组测序、水稻基因组测序先后基本或全部完成，生命科学技术不仅在原核生物，而且在真核生物，特别是在农作物上的应用局限有了根本性突破。基因工程的范围扩大到所有生物。奠定了生物工程在新世纪迅猛发展的坚实基础。生物工程是生物学技术的工业化，是生物技术和工程学的结合。
7	三、生物工程的基本内容生物工程包括所有具备产业化条件的生物技术。按照生物工程改造的对象，主要包括基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程和发酵工程5个方面。按照应用的生产部门有农业、环境、医学、卫生、公安等多个方面。基因工程是生物工程的核心。基因工程的核心技术是DNA重组。现阶段生物工程是以核酸和蛋白质为主的工程。
8	"基因工程：直接从事基因的加工..." 　　基因工程：直接从事基因的加工改造和创新，主要方法是DNA重组。　　蛋白质工程：是以人门所需的蛋白质为目的生物工程。通过蛋白质的结构反向设计、选择或修改相应基因，和基因工程获得所需蛋白质。　　酶工程：是以人们所需的酶为目的，通过基因工程和蛋白质工程获得所需的酶。已知有的酶本质不是蛋白质而是核酸，目前的酶工程仅限于本质为蛋白质的酶。　　细胞工程：是以细胞和细胞器为对象进行操作，最终获得人们所需的细胞、组织或个体。　　发酵工程：是生物工程的主要终端，通过反应器的设计和发酵工艺的建立，对获得的工程菌或细胞进行扩大生产，最终分离提取所需的生物工程产品。本讲义重点讨论生物技术在传统发酵工程的应用。
9	四、生物工程在国民经济中的地位 1)生物制药生物制药是以生产具有预防和治疗疾病的酶，激素，调节因子等生物本身就有的或通过创新但无污染的生物制剂。 2)绿色食品使用无污染的农药、肥料、种子、土壤，找到和利用自然界生物之间原有的相互制约机制生产食品。 3)环境保护在己知的各种消除污染措施中，生物技术得到广泛重视。 4)培育超级农业品种抗旱、涝、病、虫、耐盐碱且高产的新品种已经使传统农业开始发生根本性转变。
10	"5)农业现代化通过生物技术，农业..." 5)农业现代化通过生物技术，农业将逐步减少对土地和气候依赖性。许多农产品开始工厂化生产。 6)提高人类健康水平通过个人的基因组图谱，通过生物芯片，使尽早和最彻底的预防和治疗疾病成为现实。通过个人细胞克隆，实现自体器官替换移植，长生不老不死成为现实。 7)全面仿生技术 DNA计算机、生物材料的开发应用、具有各种人类感受能力的机器人等已经有成功的产品问世。
11	第二讲细胞工程
12	"序" 序第一节细胞生物学基础第二节动物细胞培养第三节细胞全能性与干细胞工程第四节核移植与克隆技术第五节植物细胞工程
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14	细胞工程的发展历史 1838，哈泊兰德预言了植物细胞的全能性； 1907，美国哈里森培养了蛙胚神经组织； 1934，荷兰温特发现生长素； 1960，英国诺丁汗大学科金教授使用酶解方法从番茄幼苗根部制备得到大量原生质体； 1972，美国卡尔森等用NaNO3为融合诱导剂，将来自不同种的烟草原生质体进行融合，获得世界上第一个体细胞杂种植株； 1977，英国胚胎工程技术，首例试管婴儿； 1997，多莉克隆羊； 2001，首例克隆猪…
15	主要研究内容动植物细胞与组织培养；细胞融合；染色体工程；胚胎工程；细胞遗传工程
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18	细胞工程重要应用优质植物快速培育与繁殖；动物胚胎工程快速繁殖优良、濒危品种；利用动植物细胞培养生产活性产物、药品；新型动植物品种的培育；供医学器官修复或者移植的组织工程；转基因动植物的生物工程反应器；在遗传学、发育学等领域的理论研究；在能源、环保等领域的应用。
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20	一、细胞的发现 1665年，英国人罗伯特•胡克使用自制的显微镜观察软木片； 1831年，罗伯特•布朗从兰科植物的叶片表皮细胞中发现了细胞核； 1835年，在低等动物根足和多孔虫的细胞中发现了细胞内含物细胞质； 1838－1839年，施旺、施莱登提出一切植物、动物都是由细胞组成的，细胞是一切动植物的基本单位，这一学说就叫做“细胞学说”。
21	细胞是生命活动的基本单位 ö细胞是生命的基本结构单位，所有生物都是由细胞组成的； ö细胞是生命活动的位功能单，一切代谢活动均以细胞为基础； ö细胞是生殖和遗传的基础与桥梁；具有相同的遗传语言； ö细胞是生物体生长发育的基础； ö细胞是生命起源的归宿，是生物进化的起点； ö没有细胞就没有完整的生命（病毒的生命活动离不开细胞）
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25	"非细胞形态的生命体—病毒" 非细胞形态的生命体—病毒病毒已发现3 000种（含40 000亚种）包括：真病毒（virus）： DNA或RNA与蛋白质构成的核酸-蛋白质复合体类病毒（viroid）：感染性的RNA构成，发现约20余种朊病毒（prion）：仅由有感染性的蛋白质构成病毒核酸有不同类型，但只有DNA或RNA其中之一。
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52	细胞的全能性
53	细胞发生发展过程图
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55	细胞凋亡细胞衰老的结果就是细胞死亡。在多细胞生物体中，除了外部的因素导致一些细胞的死亡外，还有许多细胞在生物体的控制下死亡，称为细胞程序死亡或细胞凋亡。细胞程序死亡是生物体生长、发育的正常现象，以新细胞代替代谢活力下降的老细胞可使整个个体的活力保持较长的时间，是生物体自我调节的一种表现。
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60	生物学意义发生凋亡的细胞：正常发育中多余细胞、无用细胞、突变细胞、有害细胞或衰老细胞。生物学意义：维持组织、器官细胞数目相对平衡，保证个体正常发育线虫发育中产生1090个细胞，有131个细胞必定死亡。动植物都有细胞凋亡现象。
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62	"人的一生细胞分裂10¹⁶次，..." 人的一生细胞分裂10¹⁶次，每个基因自然突变概率为10^-6，由此推断：一生中人的基因组中每个基因都可能发生10^-10次的突变，然而，事实上人的癌症发病率并没有预想的那样高。据统计，一个细胞转化需要3～7次单独的随机突变。
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68	植物组织植物组织分为分生组织和永久组织。植物发育早期，细胞陆续分化失去分裂能力，成为具有特定功能的细胞组织，即永生组织。植株体内一部分不分化的细胞，能继续分化以补充新的细胞，即分生组织，如根尖，颈尖。
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70	第二节动物细胞培养
71	1 动物细胞特点无细胞壁倍增时间长，生长缓慢需氧量少，对搅拌敏感聚集体形成原代细胞培养50代即开始退化
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73	3 生长特性贴附生长型如人胚肺细胞，Hela细胞，巨噬细胞，神经细胞悬浮生长型细胞如血液白细胞，淋巴组织细胞等
74	4 体外培养细胞基本技术体外培养特点体外培养工具体外培养条件体外细胞生长增殖过程培养方法大规模培养技术
75	4.1 体外培养特点营养条件苛刻适应性差, 敏感培养时间长，易污染
76	5.3 体外培养条件温度，37度 pH：7.2-7.4 气体，氧，二氧化碳，氮气营养条件需要多种氨基酸，维生素，辅酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生长因子，其中多种成分可以由血清提供
77	4.4 体外细胞生长增殖过程原代培养期传代培养期衰退期
78	5.5 培养方法悬滴旋转管灌注小室培养瓶培养板
79	动物细胞培养应用 1962年开始，用于生物医学研究，生产酶制剂，生长因子，疫苗，单抗等
80	Vero细胞和狂犬病毒的培养工艺
81	第三节细胞全能性与干细胞工程
82	"细胞克隆技术是为了解决正常..." 细胞克隆技术是为了解决正常情况下不再或很难分裂、分化的细胞而建立的。所谓分化，就是由一个细胞的分裂而形成各种组织或器官的过程。动物体细胞正常晴况下不能象受精卵那样转变为一个个体，但一个个体的所有细胞，无论是体细胞还是性细胞，所含的DNA或基因是一样的，这叫做细胞的全能性。细胞全能性是细胞克隆的基础。当原受精卵分化成为一个个体后，体细胞的大部分基因特别是有关负责分化的基因已经关闭且不能在一般条件下恢复(反分化)，但通过体外处理，体细胞已经能够恢复分化。
83	1、干细胞的概念与分类细胞的分化过程中，细胞往往由于高度分化而完全失去了再分裂的能力，最终衰老死亡。机体在发展适应过程中为了祢补这一不足，保留了一部分未分化的原始细胞，称之为干细胞（stem cell）。一旦生理需要，这些干细胞可按照发育途径通过分裂而产生分化细胞。干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。
84	干细胞有以下特点：（1）干细胞本身不是处于分化途径的终端。（2）干细胞能无限的增殖分裂。（3）干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态。（4）干细胞通过两种方式生长，一种是对称分裂--形成两个相同的干细胞，另一种是非对称分裂--由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀地分配，使得一个子细胞不可逆的走向分化的终端成为功能专一的分化细胞；另一个保持亲代的特征，仍作为干细胞保留下来。分化细胞的数目受分化前干细胞的数目和分裂次数控制。干细胞是具多潜能和自我更新特点的增殖速度较缓慢的细胞。
85	按分化潜能的大小，干细胞基本上可分为三种类型：　　全能性干细胞，它具有形成完整个体的分化潜能。如胚胎干细胞（简称ES细胞），具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的分化能力，可以无限增殖并分化成为全身200多种细胞类型，进一步形成机体的所有组织、器官。　　多能性干细胞，这种干细胞具有分化出多种细胞组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制，骨髓多能造血干细胞是典型的例子，它可分化出至少十二种血细胞，但不能分化出造血系统以外的其它细胞。　　单能干细胞（也称专能、偏能干细胞），这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞或叫卫星细胞。
86	胚胎干细胞（ ES细胞）当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团（Inner Cell Mass）的细胞即为胚胎干细胞。胚胎干细胞具有全能性，可以自我更新并具有分化为体内所有组织的能力。胚胎干细胞（ES细胞）是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。研究和利用ES细胞是当前生物工程领域的核心问题之一。ES细胞的研究可追溯到上世纪五十年代，由于畸胎瘤干细胞（EC细胞）的发现开始了ES细胞的生物学研究历程。德美医学小组在去年成功的向试验鼠体内移植了由ES细胞培养出的神经胶质细胞。此后，密苏里的研究人员通过鼠胚细胞移植技术，使瘫痪的猫恢复了部分肢体活动能力。人类ES 细胞的研究工作引起了全世界范围内的很大争议，出于社会伦理学方面的原因，有些国家甚至明令禁止进行人类ES细胞研究。
87	成体干细胞成年动物的许多组织和器官，比如表皮和造血系统，具有修复和再生的能力。成体干细胞在其中起着关键的作用。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。过去认为成体干细胞主要包括上皮干细胞和造血干细胞。最近研究表明，以往认为不能再生的神经组织仍然包含神经干细胞,说明成体干细胞普遍存在，问题是如何寻找和分离各种组织特异性干细胞。成体干细胞经常位于特定的微环境中。微环境中的间质细胞能够产生一系列生长因子或配体，与干细胞相互作用，控制干细胞的更新和分化。
88	造血干细胞　　　造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在于骨髓、外周血、脐带血中。今年年初，协和医大血液学研究所的庞文新又在肌肉组织中发现了具有造血潜能的干细胞。造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性和转移性恶性肿瘤疾病的最有效方法。在临床治疗中，造血干细胞应用较早，在20世纪五十年代，临床上就开始应用骨髓移植（BMT）方法来治疗血液系统疾病。到八十年代末，外周血干细胞移植（PBSCT）技术逐渐推广开来，绝大多数为自体外周血干细胞移植（APBSCT），在提高治疗有效率和缩短疗程方面优于常规治疗，且效果令人满意。 2003年初，东北地区首例脐血干细胞移植成功，又为中国造血干细胞移植技术注入新的活力。
89	神经干细胞神经干细胞的研究仍处于初级阶段。理论上讲，任何一种中枢神经系统疾病都可归结为神经干细胞功能的紊乱。脑和脊髓由于血脑屏障的存在使之在干细胞移植到中枢神经系统后不会产生免疫排斥反应，如：给帕金森氏综合症患者的脑内移植含有多巴胺生成细胞的神经干细胞，可治愈部分患者症状。除此之外，神经干细胞的功能还可延伸到药物检测方面，对判断药物有效性、毒性有一定的作用。有些科学家证实骨髓干细胞可发育成肝细胞，脑干细胞可发育成血细胞。
90	角膜干细胞　　加拿大研究人员在人、鼠、牛的视网膜中发现了始终处于“休眠状态的干细胞” - 治疗各种角膜干细胞疾病。科宇公司的此项技术已成熟，并属世界首创。到目前为止，科宇公司的干细胞治疗角膜技术已成功地完成了33例临床实验（包括轻、中、重三种不同程度的患者），并形成了完整的工艺流程，为角膜干细胞的产业化打下了坚实的基础。科宇公司在目前的实验条件下可以完成1-2万片角膜贴膜的生产。
91	2、干细胞应用平台技术　干细胞是人体内最原始的细胞。它具有较强的再生能力，在干细胞因子（SCF）和多种白细胞介素（IL）的联合作用下可扩增出各类的细胞。由于干细胞数量极少，而且在体外几天内就会裂变而失去原来的特性，所以分离、保存并在体外人工大量培养使之成长为各种组织和器官便成为干细胞研究的首要课题。随着基因工程、胚胎工程、细胞工程等各种生物技术的快速发展，按照一定的目的，在体外人工分离、培养干细胞已成为可能，利用干细胞构建各种细胞、组织、器官作为移植器官的来源，这将成为干细胞应用的主要方向。
92	"干细胞的分离与纯化" 干细胞的分离与纯化干细胞表面有许多特殊的标记，以造血系统为例，干细胞的表面标志有Sca-1和c-kit等。另外各种成体干细胞还有各自独特的标记物，如人造血干细胞表现为CD34⁺和Thy^lo而CD10，CD14，CD15，CD16，CD19，CD20皆为阴性。这些特异的标记物可能与其分化调控有关，如上皮干细胞有β1整合素的高表达，而β1整合素可介导干细胞与细胞外基质粘附从而抑制其分化的发生。另外干细胞还有不同于一般分化细胞的物理特性，比如干细胞不被染料Hoechst33324和Rhodamine123染色。利用这些特性及表面标志，采用荧光细胞分离器从单细胞悬液中即可分离纯化干细胞。
93	"干细胞的体外培养" 干细胞的体外培养由于干细胞的数目很少，因此需要在体外对干细胞进行非分化性增殖。这需要许多生长因子和间质细胞的共培养。Brustle等人在体外成功地培养了鼠的ES细胞。他们首先把分离的ES细胞在含有FGF2的培养基中培养，随后加入上皮生长因子（EGF），最后在FGF2和PDGF的混合培养基中生长增殖。在这种培养条件下，ES细胞可以保持其分化潜能，如停止供给生长因子，ES细胞会分化为寡树突细胞或星状细胞
94	"技术突破" 　技术突破最近干细胞的研究有两个重大的技术突破，一是人类胚胎干细胞在体外培养成功。1998年Wisconsin大学的James Thomson和Johns Hopkins大学的John Gearhart从人囊胚的内层细胞团中取得胚胎干细胞。他们把胚胎干细胞与小鼠的骨髓间质细胞进行了共培养。结果表明胚胎干细胞可以进行长达5个月的非分化增殖，同时还保持着分化为滋养层组织及三种胚层组织的能力。这为胚胎干细胞的临床应用奠定了基础。另外一个重大突破是成体干细胞的横向分化。1999年Goodell等人用肌肉来源的干细胞在小鼠体内分化成各种血细胞。这表明成体干细胞在一定的微环境的作用下，可以横向分化为需要的细胞和组织，从而起到极其有效的治疗作用。
95	3、干细胞的研究进展与技术的市场前景当前，对于干细胞的分离和培养技术获得了重大的进展，利用单克隆免疫吸附能识别细胞类型或细胞谱系的表面抗原，其分离纯度和细胞活力都很高。99年以色列魏茨曼科学院又将"IL-6"与干细胞内的受体分子合并研制出一种新分子，可使干细胞在维持原本特性的基础上进行自我增殖，且细胞寿命也有所延长。我国现已掌握了脐血干细胞分离、纯化、冷冻保存以及复苏的一整套技术（谭文松华东理工大学）并在上海开始筹建我国第一个脐血库，预计可保存一万份脐血样本，以缓解脐血干细胞数量不足的缺陷。在北京，北京医科大学人民医院细胞治疗中心也正在筹建一座全世界最大的异基因脐带血干细胞库，为全世界的华人患者提供脐带血干细胞做移植用。
96	"研究干细胞增殖和分化机制..." 　　研究干细胞增殖和分化机制的最终目的是应用干细胞治疗疾病。理论上讲，干细胞可以用于各种疾病的治疗，但其最适合的疾病主要是组织坏死性疾病如缺血引起的心肌坏死，退行性病变如帕金森综合征，自体免疫性疾病如胰岛素依赖型糖尿病等。　　体外制造人体器官　　干细胞的医学应用还包括体外制造人体器官，然而这比体内移植干细胞要复杂得多。干细胞和动物工程的结合将有可能解决这一问题。比如通过形成嵌合体，在严格的控制下，使动物的某些器官来源于人体干细胞。这些来自人体干细胞的器官可应用于临床移植治疗。
97	"第" 第四节核移植与克隆技术
98	"单克隆抗体细胞技术" 　　单克隆抗体细胞技术癌变就是细胞核外物质对细胞核DNA影响的结果，导致不再需要分裂的细胞开始分裂。将正常无分裂和分化能力的体细胞的细胞核DNA移入到去除原细胞核的癌细胞中，被移植的DNA也可同样恢复分裂和分化。根据这一事实，人们将携带有抗体基因的DNA移入到去掉细胞核DNA的癌细胞中，实现了抗体的大量合成。这就是单克隆抗体细胞技术。单克隆抗体技术带来了大量抗体生物合成，迈出了细胞培养历史上划时代的一步。
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102	"体细胞克隆" 　　体细胞克隆和体细胞不同，动物的卵细胞、成年期动物的乳腺细胞具有细胞分裂的能力。将体细胞的细胞核移植到去掉细胞核的卵或乳腺细胞中，体细胞恢复分裂和分化能力，不经过有性生殖，这样的体细胞也能够形成一个个体，这就叫体细胞克隆。克隆羊、猪已经成功，克隆人试验也己在准备之中。体细胞克隆的成功是20世纪末生物工程在细胞改造方面取得的重大进展。
103	"一、克隆的概念与研究历程" 一、克隆的概念与研究历程 1、什么是克隆生物的生殖方式主要是无性生殖和有性生殖，前者主要是裂殖、出芽生殖、孢子生殖等，后者包括同配、异配和卵式生殖。其本质区别在于有无配子的结合。克隆是独立细胞繁殖系，指后代完全由一个细胞复制，具有完全相同的遗传物质，它是一种特制生物学操作技术。
104	显微注射技术将外源DNA注入细胞
105	2、克隆技术的研究历程 (1)资料：中国克隆动物研究大事记 ■60年代，生物学家童第周对金鱼、鲫鱼进行细胞核移植。 ■1990年5月，西北农业大学畜牧所克隆一只山羊。 ■1992年，江苏农科院克隆一只兔子。 ■1993年，中科院发育生物学研究所与扬州大学农学院合作，克隆一只山羊。 ■1995年7月，华南师大与广西农大合作，克隆一头奶牛、黄牛杂种牛。 ■1995年10月，西北农大克隆6头猪。 ■1996年12月，湖南医大克隆6只老鼠。 ■中国农科院畜牧所克隆一头公牛犊。（以上为胚胎细胞克隆研究） ■1997年3月，陈大元率先提出了克隆大熊猫的设想。 ■1999年，中国科学院动物研究所研究员陈大元领导的小组将大熊猫的体细胞植入去核后的兔卵细胞中，成功地培育出了大熊猫的早期胚胎。
106	克隆蛙产生过程
107	克隆羊产生过程
108	（2）克隆绵羊“多利”：
109	"苏格兰黑面" 苏格兰黑面羊排卵乳腺细胞芬多席特母羊 (白) 从卵细胞中取出核　　　取出核核植入(换核) 　　　　　　　　　　　刺激换核卵试管里受精卵裂发育形成胚胎　　　　胚胎植人另一只母羊的子宫里　　　　　　　　　　　　克隆羊(白)
110	3、克隆技术的应用 (1)克隆技术造福人类 A、生物学和医药研究：如在牛、羊、兔等动物奶中产药技术。 B、获得更多的优秀动物个体用于生产 C、成体细胞核移植，他可以复制生产高价药物的动物：如羊奶中生产治疗肺气肿的抗胰蛋白酶，该羊每只6千美元。 D、挽救濒危动物：如大熊猫 (2) 动物克隆将成为新的产业：全球成立了众多的克隆技术公司。
111	二、克隆技术研究与应用的主要方向 1、保护珍惜动物克隆大熊猫面临两大问题：之一:克隆会不会影响遗传多样化?之二:克隆会不会伤害和影响大熊猫目前正常的生长发育和繁殖? 2、“克隆”人类胚胎进行疾病研究将一颗受精的卵子的细胞核植入卵子内，复制出在基因特质上一模一样的人类胚胎，在胚胎发展成胎儿之前就将其破坏，以获得研究所需的干细胞 3、克隆其它动物用于人体器官移植猪器官在生理上与人器官更为接近，而且猪具有繁殖力强的特点，克隆猪为大量获取移植器官提供了可能。 4、克隆技术发展的未来预测：
112	资料：克隆技术研究未来100年预测 2001 年，体细胞克隆狗诞生。 2001 年，体细胞克隆兔诞生。 2002 年，体细胞克隆猫诞生。 2002 年，首例克隆人诞生。很快有数家实验室宣布也做成克隆人。克隆风暴再次刮起。 2003 年，体细胞克隆猴诞生。 2004 年，体细胞克隆大鼠诞生。 2005 年，体细胞克隆马诞生。 2006 年，克隆大熊猫诞生。 2007 年，生产出的牛羊在奶中分泌贵重药品 - 乳腺反应器投入生产。动物乳房开始替代部分传统的制药工厂。建分厂只须进行克隆。 2008 年，克隆应用于器官移植。 2009 年，小鼠实现全程体外培养 - 人造子宫在日本做成。 2010 年，受体卵母细胞实现人为制造。适合常见动物克隆的卵母细胞实现商品化， 2022 年，无卵克隆（又称植物式克隆），克隆动物像植物般地从单个体细胞生长出来。 2037 年，实现核重建。克隆动物实现数字化批量生产。 2055 年，生物技术使得人的生育与性爱分离。生育由变成社会产业，完全实行机械化生产，作为社会的后备力量。 2061 年，机器人智能化。人类分为传统人、克隆人和机器人三大群体。传统人感到地位在剧烈下降。 2078 年，机器人当选某发达国家总统。 2098 年，发现外星人。 2099 年，时间概念模糊化。 2100 年，传统人举行全球游行，抗议机器人和克隆人对传统人的歧视
113	三、克隆技术相关问题 1、“试管婴儿”问题过程主要包括：药物诱发超排卵、采集卵子、精子获能、人工受精、体外培养、胚胎移植等步骤。第三代试管婴儿技术从生物遗传学的角度，帮助人类选择生育最健康的后代。 2、克隆人问题克隆人体胚胎已经变为现实正确面对克隆人问题不可能克隆出完全相同的人 3、干细胞研究
114	克隆人技术过程
115	"4、克隆动物存活问题..." 4、克隆动物存活问题至今尚未解决 5、植物基因克隆技术简介　　植物基因的克隆技术为进一步研究诸如各种调节植物生长发育的基因、逆境与防御反应的基因、植物细胞凋亡的基因等提供了新的途径。　　常用的目的基因克隆技术：　　1、通过已知基因产物的分析和鉴定　　2、通过遗传表型分析　　3、以图谱为基础的定位克隆技术　　随着新的基因资源的不断发掘，作物的许多性状诸如产量、品质、抗性，植株的形态、熟期、花器发育的调节，以及一些复杂的生理生化性状等都可望得到进一步的改良。
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122	"植物细胞工程，就是进行物种..." 植物细胞工程，就是进行物种改良，选育优良作物品种，增加植物的优良性状，利用植物生产各种化学制品，还可用于保留濒危灭绝和有重要经济价值的植物物种。
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124	植物细胞工程技术：　　一、快速繁殖技术　　通过植物体细胞胚胎再生成一完整植株。这种技术主要用于花卉、树木、蔬菜、果树、中草药和农作物的快速繁殖。　　二、诱导增加或减少植物体内染色体组数的技术　　有些植株的染色体比正常细胞少一半（单倍体），而有些经诱导后染色体加倍（多倍体）。单倍体对植物品种的改良很有利；多倍体产量高，为不同倍性植物间的杂交提供了遗传保证。　　三、体细胞杂交技术　　利用自然或人工方法使两个工几个不同细胞融合成一个细胞，形成体细胞杂种。　　四、植物细胞应用生产技术　　利用植物细胞培养技术，给植物细胞提供最适宜的生活环境，让它们进行无性繁殖，大量地培养成植株，解决天然资源的不足。
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131	第三讲　蛋白质工程
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133	"蛋白质工程是以蛋白质结构功能..." 　　蛋白质工程是以蛋白质结构功能关系的知识为基础，通过周密的分子设计，把蛋白质改造为合乎人类需要的新的突变蛋白质。　　1983年，美国生物学家额尔默首先提出了“蛋白质工程”的概念。蛋白质工程的实践依据DNA指导合成蛋白质，因此，人们可以根据需要对负责编码某种蛋白质的基因进行重新设计，使合成出来的蛋白质的结构变得符合人们的要求。由于蛋白质工程是在基因工程的基础上发展起来的，在技术方面有诸多同基因工程技术相似的地方，因此蛋白质工程也被称为第二代基因工程。
134	"蛋白质工程第一个十分成功的范例..." 蛋白质工程第一个十分成功的范例是胰岛素的人工合成。1965年，中国科学院和北京大学生物系联手首次人工合成了牛胰岛素，成了轰动世界的大事。　　1953年，英国生物化学家桑格破译出由17种51个氨基酸组成的两条多肽链牛胰岛素的全部结构。这也是人类第一次搞清一种重要蛋白质分子的详细结构。从1958年开始，中国科学院上海生化研究所、上海有机化学研究所和北大生物系三个单位联合成立一个协作组，开始探索用化学方法合成胰岛素。1965年9月7日，协作组完成了结晶牛胰岛素的全合成。经过严格鉴定，这种人工合成的结晶牛胰岛素在结构、生物活力、物理化学性质、结晶形状上都与天然的牛胰岛素完全一样。人工合成结晶牛胰岛素是世界上第一个人工合成的蛋白质，为人类认识生命、揭开生命奥秘迈进了一大步。
135	蛋白质工程与基因工程的区别　　蛋白质工程在诞生之日起就与基因工程密不可分。基因工程是通过基因操作把外源基因转入适当的生物体内，并在其中进行表达，它的产品还是该基因编码的天然存在的蛋白质。蛋白质工程则更进一步根据分子设计的方案，通过对天然蛋白质的基因进行改造，来实现对其所编码的蛋白质的改造，它的产品已不再是天然的蛋白质，而是经过改造的，具有了人类所需要的优点的蛋白质。天然蛋白质都是通过漫长的进化过程自然选择而来的，而蛋白质工程对天然蛋白质的改造，好比是在实验室里加快了的进化过程，期望能更快、更有效地为人类的需要服务。
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137	附：蛋白质分子结构
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163	1、改造天然蛋白质的必要性 1. 发展生产需要在长期生产实践中，积累了许多要解决的实际问题。人们的饮食需要必需氨基酸含量高，种类全的蛋白质。预防疾病需要大量来自人体本身就有的酶，激素，抗体，调节因子。发酵工业需要耐热、耐酸碱，高活性的酶制剂。农业需要高蛋白，抗虫、病，耐盐碱，耐干旱的新品种。材料工业需要高贮存信息能力，高强度，无污染的生物材料。 2. 基础研究蛋白质合成机理，蛋白质折叠机理，蛋白质序列语言的语法研究。生命起源与蛋白质分子进化，生物的寿命与蛋白质代谢的研究。概括起来，蛋白质工程的目的是改变蛋白质的生物活性，改变蛋白质的稳定性，改变蛋白质的特性和用于蛋白质与功能研究。
164	2、蛋白质工程的类型 1. 从头设计完全按照人的意志设计合成蛋白质。设计的蛋白质是自然界从来没有的。这是蛋白质工程中最有意义和困难的操作类型。在蛋白质类药物工业需要这样的技术。例如对付艾滋病，人们根据艾滋病毒壳蛋白的结构，设计出能够将其水解的酶。蛋白质从头设计技术目前尚不成熟，已经合成的蛋白质只是一些很小的短肽。 2. 定点突变与局部修饰在已有的蛋白质基础上，只进行局部的修饰。有些蛋白质，例如胰岛素，人门一直希望能不通过注射而进入人体作用，从而减轻病人每天几次注射带来的痛苦，和因此感染疾病的机会。因此设想将胰岛素的结构加以修饰，避免人体消化道酶的水解破坏。
165	3、蛋白质工程的基本程序蛋白质结构基因的克隆一一一一一一一一一→ DNA测序 ...↑ 　　...........↓　　　......................　　....↓ ...↑ 　　.......基因的表达　　　.......................↓ ...↑ 　　..........↓　　　　 ......................蛋白质测序 ...↑ 　　........纯蛋白质　　　　.......................↓ ...↑ 　　...........↓　　　　　.......................... ↓ ...↑ .....蛋白质晶体学分析←一一一一→ 蛋白质结构预测 ...↑ 　　　　　　　........................................↓ ...↑ 　　　　　　　........................................↓ ...↑　　　　　　 ...................................三维结构模型 ...↑ 　　　　　　　........................................↓ ...↑　　　　　　　........................................ ↓ 基因定位突变/人工合成基因 ←←←←← 序列改变的设想/新型蛋白质的设计
166	"从上面的蛋白质工程程序可知..." 从上面的蛋白质工程程序可知，蛋白质工程是根据已知蛋白质结构的知识创新的过程。首先要测定蛋白质中氨基酸的顺序，测定和预测蛋白质的空间结构，建立蛋白质的空间结构模型，然后提出对蛋白质的加工和改造的设想，通过基因定位突变和其它方法获得需要的新蛋白质的基因，进而进行蛋白质合成。这一过程不是一次就能完成的，需要反复尝试，才能得到所需要得蛋白质。
167	（1）、蛋白质的测序蛋白质测序的基本原理是重叠对比法。 1. 将已经纯化的蛋白质各条链分开，每一条链用至少两种不同的方法(切口不同)切割为两套小的片段； 2. 用Endaman方法测定每一片段的顺序； 3. 将两套片段的顺序进行对比分析，依靠片段之间序列的重叠建立相邻关系，最后得出每一条链的全部序列。
168	（2）蛋白质空间结构的测定蛋白质空间结构测定主要是用X射线衍射的方法，此方法的最大局限性是要将蛋白质制成极难获得的结晶。近年来二维核磁共振的应用取得一定进展，核磁共振测定蛋白质空间结构不需要蛋白质晶体。
169	（3）蛋白质空间结构的预测　蛋白质空间结构预测研究是世界难题，历经30余年，至今没有根本突破。取得的初步结果如下： 1. 一级结构决定空间结构即只要合成了某种蛋白质的一级结构，空间结构自动形成。我国科学家在世界上首先合成胰岛素的实践证实了这一论断。但也有争议。 2. 蛋白质有结构上的分子进化同源性同源蛋白概念由此而来。由此也产生了相关蛋白质空间结构预测的方法，在预测一种新的蛋白质空间结构时，首先在已知的蛋白质空间结构数据库中查找是否有和此种蛋白质同源的蛋白质，当找到与此同源的蛋白质时，新的蛋白质空间结构就有可能和找到的同源蛋白质空间结构相似，预测时在采用的方法上进行选择，避免较多的盲目性。人们已经建立了同源蛋白质数据库。通过计算机可以随时查询。
170	"3" 3. 蛋白质的空间结构可以划分为一定的单元不同蛋白质可以有相同的空间结构单元。人们已经建立了多套蛋白质空间结构单元数据库。而且预言，自然界蛋白质的空间结构模式大约有600余种，当这些模式蛋白质数据库完全建立之后，以后的预测工作仅仅是在计算机上寻找与其相同的模式蛋白质。 4. 蛋白质中氨基酸残基之间有长距离和短距离相互作用蛋白质中的氨基酸残基不是彼此孤立的，整个空间结构是所有氨基酸残基相互作用的结果。了解这个机理将是对蛋白质折叠机理最根本的认识，如同英语语法，氨基酸序列的20个字母的语法就是氨基酸残基的相互作用规律 5. 可能有蛋白质折叠密码存在蛋白质折叠码被认为是继发现遗传密码之后的第二生物密码，这一密码在什么物质上，有可能在蛋白质上，也有可能在tRNA上，目前都没有定论。
171	4、蛋白质工程的典例 1. HIV蛋白水解酶的设计 HIV蛋白水解酶在HIV(人体免疫缺损病毒，又称艾滋病病毒)进入人体过程中发挥如同一只往人体细胞打孔的钻机的作用，如果将其活性抑制，HIV将无法进入人体细胞。HIV蛋白水解酶由两个99个氨基酸残基的单体组成，其活性中心有一个起关键作用的天冬氨酸残基，故属于天冬氨酸水解酶类，这一类酶的种类不少，晶体结构已知，催化机理也已基本清楚。美国Abbott和DuPontMerck制药公司分别用计算机设计合成了HIV蛋白水解酶抑制剂。
172	"2" 2. 新型胰岛素的设计天然胰岛素必需经注射才能发挥降低血糖的作用，如果生产出可口服且长效的胰岛素，市场前景毋庸置疑。我国科学家一直致力于此项研究，设想合成一种由多个胰岛素分子聚合起来的胰岛素多聚体。 3. 天花粉蛋白修饰天花粉蛋白抑制肿瘤细胞的生长和艾滋病病毒的复制，但毒副作用很强，例如在春天人们的体表因天花粉出现的过敏。如何降低其毒性，人们发现天花粉蛋白引起毒副作用的结构部分和有用的活性部分是可以分离的。
173	"4" 4. 抗体人源化当前用鼠等动物生产人的抗体容易引起不利的免疫反应。若将抗体改造成非人非鼠的抗体(改型抗体)，抗体容易引起对人不利的免疫反应将得到解决。 5. 生物计算机材料生物对光、温度等感受的能力，特别是速度要比任何半导体材料快得多，嗜盐菌中的将光转化为化学能的BR蛋白已经用于计算机图像检测器。用生物材料制造计算机不仅提高了计算机的处理速度，也减少了废旧计算机污染处理的难度。
174	5、蛋白质工程特例－酶工程 1 化学酶工程　酶制剂目前扩大酶来源的主要方法是发酵技术。将含有所需酶的微生物在发酵罐中扩大培养，然后收集发酵液(外分泌酶)或菌体(体内酶)，菌体要经细胞破碎，然后分离纯化。固定化酶收集到的酶经过载体吸附，包埋制成固体便成为固体酶。多酶一起固定时也可直接采用菌体进行固相化这称之为固相化细胞，如果被固定的细胞是活的，在使用过程中可不断增殖，又称为固相化增殖细胞。细胞增殖过程同时也是所需的酶量增加的过程，固相化的细胞可以反复使用。从而实现了连续发酵。
175	"2 生物酶工程" 2 生物酶工程定义和蛋白质工程一样，只不过需要的仅是酶。定点突变可以改变酶的耐热、耐酸碱等特性。DNA重组可以创造自然界没有的酶，可以增加酶的生物合成量。
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178	第四讲　发酵工程
179	序：什么是微生物病毒细菌远古细菌藻类真菌原生生物
180	"传统发酵已有相当长的..." 传统发酵已有相当长的的历史，春秋时代的孔子已经借酒助兴了。传统发酵技术工业化不过是发酵使用的设备的更新带来了规模的扩大。只有在生物工程到来之后，发酵工业开始采用工程菌，使得通过发酵获得的产品一改过去以酒和调味品为代表的旧貌，开始了以生物制药为代表的大飞跃。 1857年，法国微生物学家巴斯德发现了发酵原理，人们才认识到发酵是微生物活动的结果。此后，随着纯种微生物的分离及培养技术的建立，以及密闭式发酵罐的设计成功，使人们能够利用某种类型的微生物，在人工控制的环境条件下，进行大规模的生产，逐步形成了发酵工程。生物工程的最终阶段是发酵。不仅是来自微生物，而且来自动物和植物细胞合成的物质都可以通过发酵来生产。农牧业工厂化的趋势之一是逐步转向发酵。发酵生产周期短，容易调控。
181	"19世纪末：厌氧发酵（酒精、乳酸..." 19世纪末：厌氧发酵（酒精、乳酸、发酵食品） 1945年：通气搅拌发酵罐--好氧发酵（青霉素等抗生素） 20世纪50年代：代谢控制发酵（氨基酸、核酸等） 20世纪70年代：固定化酶连续发酵 20世纪80年代：现代发酵工程技术（与基因操作技术相结合） 20世纪末：人类基因组计划
182	1、发酵工程的概念和内容（1）概念发酵工程是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。发酵工程的内容包括菌种的选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯等发酵工程是“研究利用微生物的工业，即微生物参与的工艺过程”。
183	（2）应用发酵工程的生产实例　　谷氨酸是鲜味剂味精的主要成分，以前用植物(如大豆)蛋白质水解法生产。1957年，日本率先用微生物发酵法生产成功。常用的谷氨酸产生菌有谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌等。培养基通常用豆饼(或马铃薯等)的水解液、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、氧化钾、硫酸镁、生物素等配制而成，呈液体状态，因此也称培养液。其中的生物素是生长因子。培养液配制完成以后，投放到发酵罐中，通入98kPa的蒸汽进行灭菌，冷却后，在无菌条件下加入菌种，即为接种。发酵罐是一种圆柱形的容器，容量从几升到几百万升不等，上面连接有通气、搅拌、接种、加料、冷却等装置；此外，还有对温度、pH、通气量与转速等发酵条件进行检测和控制的装置(如图)。
184	"谷氨酸棒状杆菌是好氧菌..." 谷氨酸棒状杆菌是好氧菌，因此，发酵过程要不断地通入无菌空气，并通过搅拌，使空气形成细小的气泡，迅速溶解在培养液中(称溶氧)；同时，也能使菌种与培养液充分接触，提高它们对原料的利用率。在温度为30～37℃、pH为7～8.0的条件下，经28～32h，培养液中就会生成大量的谷氨酸。最后，将谷氨酸从培养液中分离提取出来，通常每升培养液中能得到谷氨酸50～100g。提取出来的谷氨酸用适量的Na₂CO₃溶液中和后，再经过过滤、浓缩、离心分离等步骤，便制成了味精。
185	（3）发酵的类型按照是否需氧，发酵分为好氧和厌氧两大类，是否需氧是由所使用的细胞或菌株的代谢特性决定的。好氧发酵 (aerobic fermentation) 发酵过程需要氧气。多数有机酸，如醋酸、柠檬酸和各种氨基酸的发酵生产菌需要氧气。发酵所需的氧气是以无菌空气方式供给的。不断搅拌促进氧气进入发酵液。厌氧发酵(anaerobic fermentation)发酵过程无需氧气，不搅拌。酵母菌酿酒，乳酸菌生产乳酸，瘤胃细菌分解纤维素过程不需要氧气。按照使用的细胞类型，发酵分为：微生物发酵：植物细胞发酵；动物细胞发酵。动植物细胞的发酵历史很短。通常所说的发酵主要是指微生物发酵。
186	（4）发酵的意义 1.获得用其它方法不易获得的物质酒精等有机物质，生物碱、激素、酶、蛋白质、核酸、复杂的多糖等物质至今要靠发酵来获得。化学合成的成本太高，有些物质目前还不合拥化学方法合成，例如有旋光活性的氨基酸，D、L型的挑选要用酶的立体专一性解决。用化学方法生产酶至少现在几乎不可思议。 2.获得菌体有些微生物菌体，如人体所需的双歧乳酸菌，是以活的菌体为需要对象。 3.转化为用其它方法不能或不易转化的物质自然界第一位的材料是纤维素。目前纤维素的分解主要靠生物分解。牛、羊瘤胃中细菌分解纤维素的能力是化学方法无法相比的，这样的转化产物是乳汁且无污染，而化学方法最多的转化产物是纸以及造纸所产生的大量有污染的废水。
187	2、发酵工程的工艺流程发酵生产的设备发酵罐又叫反应器，有通风和嫌气两类。前者用于好氧发酵，后者用于厌氧发酵。也有同时适合于两种类型的发酵罐。物料处理和运输设备如磨碎机、筛选机、输送机等，用于将原料粉碎和传输至发酵罐：空气调节和除菌设备调节空气的湿度�